بیان گذرای ژن درگیاهان

زراعت مولکولی در گیاهان به دو روش دائم و موقت انجام پذیر است. روش موقت یک متد کارا جهت تست نمودن سازه ها و همچنین کنترل پروتئین تولیدی از نظر تا خوردگی صحیح و فعال بودن آن قبل از تولید انبوه آن می باشد چراکه تولید گیاهان تراریخت پروسه ای زمان بر و همچنین پر هزینه می باشد . به طور کلی می توان گفت که بیان موقت در مقایسه سیستم بیان ژنی سریع، انعطاف پذیری است که تحت تاثیر "اثر محل"  نمی باشد، بر خلاف بیان دائم که تحت تاثیر اثر محل می باشد . بیان ژن در گیاهان می تواند تاثیرات سو بر رشد و عملکرد گیاه بگذارد که این عیب در سیستم های بیانی موقت دیده نمی شود، برای مثال در روش بیان موقت با کمک ناقلهای ویروسی که در مراحل تجاری می باشند، رشد گیاه در مرحله ایی تحت تاثیر قرار می گیرد که زمان برداشت است و در واقع خسارتی به عملکرد مورد نظر وارد نمی شود. یکی از بزرگترین کاربردهای بیان گذرا مخصوصا روش هایی مانند نفوذ با خلاء که در آنها نیازی به وجود کل گیاه نمی باشد، این است که می توان بدون نگرانی از مسائل فرار ژن و سایر موارد اخلاق زیستی از آن استفاده نمود. برای مثال این امکان وجود دارد که برگ گیاهان دارویی از محل طبیعی رویش آنها جمع آوری شده و در آزمایشگاه در جهت افزایش تولید ماده موثره دارویی و یا حتی تولید محصول جدید تراریخت شده و ظرف مدت کوتاهی مثل 3 روز محصول ما برداشت شود.

انواع مختلفی از بیان موقت وجود دارد برای مثال می توان روشهای، انتقال بیولیستیک DNA خالی، نفوذ اگروباکتری نوترکیب، آلوده سازی با ناقلین تغییر یافته ویروسی و نفوذ با خلاء.

DNA خالی معمولا وارد تعداد کمی از سلولها می شود و برای رونوشت برداری باید وارد هسته سلول شود. در متد نفوذ با خلاء تعداد سلولهای بیشتری DNA را دریافت می کنند و به دلیل کمک پروتئین های  اگروباکتری T-DNA به صورت فعال وارد هسته می شود. در سیستم ویروس الودگی بطور سیستمیک در کل گیاه پخش شده و اکثر سلولهای آن را تحت تاثیر قرار می دهد ضمنا نسخه برداری توسط RNA ویروسی در سیتوپلاسم و مستقل از هسته انجام می گیرد و خود این امر سبب ازدیاد نسخه های RNA و بیان بیشتر ژن می شود. در روش بمباران با تفنگ ژنی معمولاً تعداد كمی سلول مورد هدف قرار می‌گیرند و برای رونویسی DNA مورد نظر باید حتما" DNA به هسته سلول وارد شده باشد. روش اگرواینفیلتراسیون نسبت به تفنگ ژنی تعداد بسیار بیشتری سلول را مورد هدف قرار می‌ده. اگرچه انتقال DNA خالی به گیاه روش سریعی جهت کنترل نمودن مقدماتی سازه و بیان ژن به شمار می رود ولی روش مناسبی برای تولید در مقیاس های بالا نمی باشد چرا که این روش علاوه بر پیچیدگی بیش از حد  به تجهیزات جانبی زیاد و گران قیمتی نیاز دارند. روش تفنگ ژنی اغلب برای بررسی پایداری پروتئین نوتركیب قبل از انتقال ژن به صورت  پایدار  به گیاه استفاده می‌شود ولی روش مناسبی برای بیان مقادیر زیاد پروتئین خارجی نیست. این روش بیشتر برای دوباره تولید كردن دانه‌های غله تراریخت مورد توجه قرار می‌گیرد.
راندمان تولید در این سیستمها در انتقال DNA خالی کمتر از سایر روشها می باشد و در مورد نفوذ با خلاء در حدود 10 mg پروتئین نوترکیب در هر کیلوگرم برگ می باشد، چنانچه ویروس به طور سیستمیک گیاه را آلوده کند میزان پروتئین تولیدی از نفوذ با خلاء بیشتر می شود.

ناقل های ویروسی
این ناقلها یکی از انواع روش های انتقال موقت بسیار موفق هستند. در اینجا ژن مورد نظر ما به درون ژنوم ویروسی که پاتوژن گیاه می باشد، کلون می شود. معمولا این ژن را تحت بیان یک پروموتور بسیار قوی قرار می دهند و سپس این ویروس ها را تکثیر می کنند و عموما ژن هدف در سطح بالايي بيان مي‌شود زيرا در طول همانند سازي ويروس، تعداد زيادي نسخه از ژن مورد نظر ما هم رونويسي مي‌شود. برخی از ویروسهای گیاهی دامنه میزبانی وسیعی دارند و طیف وسیعی از گیاهان را با روش های انتقال مکانیکی آلوده میکنند. این ویروس ها به ما این امکان را می دهند که سطح وسیعی از یک مزرعه را به سادگی تراریخت نمائیم. اخیراً آزمایشاتی در زمینه تولید مقادیر تجاری انجام شده كه در این آزمایشات از وكتورهای ویروسی برای تولید پروتئین نوتركیب استفاده شده است. برای مثال یك شركت  از وكتور خاصی  كه از روی ساختار ویروس موزائیك توتون ساخته شده، برای تولید آنتی ژن سطحی هپاتیت ب، آنتی بادی های تك زنجیره ای، و دیگر پروتئین‌های نوتركیب استفاده كرده ‌است.
از میان تمامی ویروس های گیاهی که کمتر از 20% آنها از DNA به عنوان ماده ژنتیک استفاده می کنند خانواده ژمینی ویروس به صورت توالی های بیانی پروتئینهای خارج کروموزومهای گیاهی به کار رفته اند. ولی این سبب نمی شود که نقش مهم ویروسهای RNA دار را نادیده بگیریم، این ویروس ها توانایی آلودگی شدید و ایجاد تعداد نسخه های زیادی mRNA دارند که همین نکته آنها را تبدیل به ناقلهای بیانی بسیار مناسبی می کند. بدیهی است که در اینجا باید از روی ژنوم بیانی در ابتدا یک رونوشت RNA تهیه نموده و یا در صورت لزوم و در بعضی موارد از روی رشته روبروی آن رونوشت RNA شاخته شود [*40]. نکته مثبت این است که ژنوم ویروسی کلون شده قابلیت آن را دارد که با استفاده از تکنیک های معمول دستکاری DNA دست ورزی شود.
چندین روش برای وارد کردن ژن خارجی به درون ژنوم ویروسهای گیاهی وجود دارد، برای مثال می توان موارد زیر را نام برد:

•    جایگزینی ژن ، که در آن ژن های غیر ضروری ویروس مثل پوشش پروتئینی با ژن مورد نظر ما جایگزین می شود.
•    وارد کردن ژن، که در آن ژن مورد نظر ما تحت قدرت بیانی یک پروموتر قوی به ژنوم ویروسی ما اضافه می شود.
•    آمیختگی ژن ، که در آن ژن مورد نظر ما به نحوی وارد ژنوم ویروسی می شود که به همراه ژن های لازم ویروسی بیان می شود.

اینکه کدام یک از موارد فوق مورد استفاده قرار گیرد بستگی به سیستم میزبان/ویروس و ژن مورد نظر ما دارد، بعضی از ویروس ها به شدت به سایز خود حساس هستند و در مورد آنها جایگزینی معمولا تنها روش ممکن می باشد. برای مثال وارد کردن ژن وقتی مطلوب است که توالی بیانی بزرگی را بخواهیم بیان کنیم و آمیختگی معمولا به ژن های پروتئین کپسید انجام می گیرد و معمولا پروتئین ما متصل به سطح ویروس می ماند [*41]. برای آلوده کردن گیاهان روش های زیادی وجود دارد مثلا در مورد بعضی از ویروس های RNA دار به سادگی ماده تلقیح روی سطح گیاه مالیده می شود.
وكتورهاي ويروسي براي بيان آنتي بادي هاي تك زنجيره اي در گياهان به كار رفته اند. ناحية‌كد كنندة‌ آنتي بادي تك زنجيره اي تحت كنترل يك پروموتر ساب ژنوميك قوي پروتئين پوششي، به ژنوم ويروس وارد مي‌شود. قابل ذكر است كه پروتئين پوششي براي توانايي عفونت سيستميك و  طولاني مدت ويروس ضروري است. اين روش براي بيان زنجيره سبك و سنگين يك آنتي بادي، با طول كامل، در دو وكتور ويروسي مختلف هم لنجام شده است،  اما معمولاً به پروتئين‌هاي كوچكتر از 30 كيلو دالتون محدود مي‌شود. اين امر نشان مي‌دهد كه سيستم وكتور ويروسي قادر به بيان كمپلكس‌هاي پروتئيني چند تركيبي نيز هست، اما در اين حالت سطح بيان به ميزان زيادي كاهش خواهد يافت. بهبود اين روش نيز با تقويت و افزايش تلقيح مؤثر، مثلا تركيب كردن DNA هاي ويروسي نوتركيب كلون شده با بمباران ذرات يا با تكنيكي بر پاية ‌اگروباكتريوم مثل آلودگی به کمک اگروباکتریوم ، ميسر خواهد بود. البته بايد هنوز تحقيقات ديگري در اين زمينه براي پاسخ به چندين سئوال عمده انجام گيرد، از جمله: پايداري ژنومي ويروس‌هاي نوتركيب،  ممانعت و مداخلة ‌فيوژن پروتئين پوششي با مونتاژ شدن ويروس ( وجود يك پروتئين همراه با پروتئين پوششي روي مونتاژ شدن ذرة ‌ويروس تأثير منفي دارد) و بسته بندي شدن ذرات ويروسي. نکته ای که باید در استفاده از ویروس ها توجه نمود کنترل شدید آنها می باشد تا مشکلات زیست محیطی ثانویه ای برای ما بوجود نیاورند.


نفوذ اگروباکتری

اگرواینفیلتریشن به اگروباکتری اجازه ورود به درون سلولهای دست نخورده و سالم را از طریق نفوذ تدریجی به کمک خلأ، می دهد.  هنگامی که باکتری وارد برگ می شود با بیان پروتئین های خاصی سبب كاتالیز انتقال ژن مورد نظر به سلول‌های میزبان می شود و بیان پروتئین را سه روز بعد از نفوذ می‌توان تشخیص داد.
 

استراتژی های بیان گذرا با استفاده از وکتورهای ویروسی. ژن مورد نظر پس از کلون شدن در پلاسمید (A) DNA پلاسمید وارد هسته سلول گیاهی می شود و پس از آن mRNA از هسته خارج شده و در سیتوپلاسم ترجمه می شود. (B) اگروباکتری فعال به سلول گیاهی متصل می شود و T-DNA بطور فعال وارد هسته می شود. و از همان جا به RNA نسخه برداری می شود. (C) بعد از آلوده سازی RNA ویروسی در سیتوپلاسم به تعداد بسیار زیاد تکثیر می شود و ویروس بطور سیستمیک در کل گیاه پخش می شود.
 همانند روش‌های متداول در تولید گیاهان تراریخت‌، ژن مورد نظر در یك وكتور دوگانه كلون می‌شود و این وكتور به سویه مناسب اگروباكتریوم انتقال می‌یابد. باكتری را كشت می‌دهند و وقتی به فاز رشد تصاعدی  رسید، با سانتریفیوژ و دوباره حل كردن جمع‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌آوری می‌شوند و این سوسپانسیون باكتریایی، برای نفوذ تدریجی به برگ تحت خلأ به كار می‌رود. ابتدا برگ‌های گیاه توتون در سوسپانسیون باكتریایی قرار داده می‌شوند و یك خلأ مداوم برای مدت زمان كوتاهی اعمال می‌شود. بعد از آزاد شدن سریع خلأ برگ‌ها با آب استریل آبكشی و شسته می‌شوند، روی كاغذ خشك ‌كن واتمن در یك پلیت قرار داده می‌شوند، و به مدت 3 تا 5 روز در شرایط دوره‌ای نور 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای oC 23 قرار می گیرند. بعد از طی زمان مورد نیاز پروتئین های بیان  شده از برگ استخراج می‌گردند.
در واقع اگروباكتریوم‌ها از محصولات ژن های باكتریایی برای انتقال مؤثر DNA تراریخت به سلول گیاه، جایی كه ژن مورد نظر باید بیان شود، استفاده می‌كنند. برخلاف تولید گیاهان تراریخت، هیچ  پایش برای تشخیص سلول‌های تراریخته مورد نیاز نیست زیرا تنها بافت برگ برای تولید پروتئین به كار می‌رود. اعتقاد بر این است كه T-DNA انتقال یافته به سلول گیاه در طی این زمان نمی‌تواند به كروموزوم میزبان وارد شود، اما در عوض در هسته قرار می‌گیرد، جایی كه باید رونویسی شود، و این منجر به بیان موقت ژن مورد نظر می‌شود. یك مزیت عمده این تكنیك این است كه ژن‌های چندگانه می‌توانند در جمعیت‌های مختلف اگروباكتریوم بیان شوند و بنابراین مونتاژ پروتئین‌های پیچیده چند بخشی را می‌توان درگیاه بررسی نمود و با موفقیت به انجام رسانید. در مورد گیاهان تراریخت این امر فقط از طریق آزمایشات بسیار وقت گیر آمیزش لاین ‌های تراریخت منفرد با یكدیگر، كه هر كدام تركیب خاصی از پروتئین کل را بیان می‌نمایند، امكان پذیر است.
با استفاده از روش اگرواینفیلتراسیون، آنتی بادی های تك زنجیره ای، زنجیره سبك و سنگین Ig ها و نیز آنتی‌بادی كایمریك موشی ـ انسانی ضد آنتی ژن كارسینومای جنینی را در برگ گیاهان به طور گذرا بیان كرده‌اند. برای بیان آنتی بادی با طول كامل، ژن‌های مربوط به زنجیره سبك و سنگین آنتی بادی به طور مجزا به دو وكتور در دو سویه ‌اگروباكتریوم نوتركیب وارد می‌شوند وهمزمان این دو سویه باكتریایی به برگ نفوذ می‌كنند. آنتی بادی كامل و فعال  با بیان همزمان هر دو ژن، در سلول میزبان  مونتاژ می‌شود. با كمك این تكنیك می‌توان به آسانی سیستمی طراحی كرد كه كمپلكس‌های پروتئینی چند واحدی را بیان و مونتاژ كند. در بعضی كمپلكس‌ها می‌توان برخی تركیبات را با تركیبات دیگر در یك آگروباكتریوم نوتركیب به راحتی عوض كرد و در نتیجه ساختار‌های چند ژنی را در یك زمان آزمون و بررسی كرد. اگرواینفیلتراسیون یك روش سریع است و در عین حال مقدار كافی از پروتئین، برای تعیین خصوصیت كردن پروتئین و بررسی اولیه پایداری و عمل آن، تولید می‌كند. نكته مهم این كه اگرواینفیلتراسیون می‌تواند در مقیاس بالا هم به كار رود و ده‌ها میلی‌گرم پروتئین نوتركیب تولید نماید. حتی ممكن است برای آزمایشات پیش كلینیكی هم مناسب باشد، بدون آن كه نیاز به تولید گیاه تراریخت پایدار وجود داشته باشد. بهینه كردن روش اگرواینفیلتراسیون را می‌توان با آنالیز لاین‌های مختلف باكتری و سلول‌های میزبان، تولید وكتورهایی با حداقل اندازه به منظور انتقال مؤثرتر ژن،  و به كارگیری شرایط مناسب و بهینه نفوذ برای یك گونه ‌گیاهی خاص، انجام داد. این سیستم برای آزمون ساختار و عملكرد پروتئین بیان شده‌ حاصل، قبل از تولید گیاه تراریخت پایدار به كار می‌رود.