تعیین محل ژن روی ناحیه خاصی از یک کروموزوم

مطالعات با استفاده از هیبریدهای انسان - جونده ، انتساب یک ژن به کروموزوم خاصی را مقدور می‌سازند. با جداسازی کروموزومهای انسانی دارای ساختمان غیر طبیعی ، در هیبریدهای سلولهای پیکری می‌توان قدرت تفکیک را بالا برد. اگر ژن خاصی فقط در آن دسته از هیبریدهایی که کروموزوم حذف شده یا جابجا شده دارند موجود باشد، می‌‌توان محل ژن را در بخش از کروموزوم حفظ شده در هیبریدها تعیین کرد. از طرف دیگر ، اگر محل ژنی روی یک کروموزوم خاص معلوم باشد، اما این ژن در هیبریدی حاوی یک نسخه حذف شده یا جابجا شده از آن کروموزوم وجود نداشته باشد، محل ژن را می‌توان به بخش کروموزوم غایب منتسب کرد. 

نقشه برداری هیبرید پرتویی

اگر چه هیبریدسازی سلولهای پیکری با کروموزومهای واجد ساختمان غیر طبیعی می‌تواند محل یک ژن را روی بخش خاصی از یک کروموزوم تعیین کند، نواحی کروموزومی مشخص شده هنوز در مقایسه با اندازه یک ژن متوسط ، کاملا بزرگ محسوب می‌شوند. با نقشه برداری هیبرید پرتویی ، می‌توان نقشه برداری ژنی را با قدرت تفکیک به مراتب بالاتر انجام داد. در این روش ، سلولهای انسانی را تا حد کشنده‌ای تحت اشعه ایکس قرار می‌دهند تا کروموزومها قطعه قطعه شوند وسپس آنها را با سلولهای پیکری یک جونده که فاقد آنزیم هیپوگزانتین گوانین فسفوریبوزیل ترانسفراز است، هیبرید می‌کنند.

هیبریدهای حاوی قطعات کروموزومی انسانی را می‌توان به کمک انتخاب در محیط کشت HAT از هم جدا کرد، زیرا هیبریدهای حاوی قطعه کروموزوم حامل هیپوگزانتین گوانین فسفوریبوزیل ترانسفراز (HPRT) ، همیشه واجد نوعی آرایش تصادفی قطعات کروموزومی انسانی دیگر نیز می‌باشند. سلولهای انسانی ادغام نشده ، بر اثر صدمه کروموزومی شدید می‌میرند. در حالی که سلول های ادغام نشده سلول جونده فاقد (HPRT) در محیط کشت HAT می‌میرند.

هر چه دو ژن انسانی روی کروموزوم به هم نزدیکتر باشند، احتمال بروز شکستگی ناشی از پرتو ایکس بین آنها کمتر است. در نتیجه دو ژن مجاور هم از نظر فیزیکی ، در بسیاری از هیبریدهای یکسان حفظ می‌شوند. اما ژنهایی که نزدیک یکدیگر نیستند، معمولا روی قطعات کروموزومی مختلف قرار دارند و در هیبریدهای یکسان موجود نیستند. نوعی تجزیه و تحلیل آماری در مورد اینکه میزان همبستگی دو ژن در دودمانهای هیبرید پرتویی چقدر است، سنجشی از فاصله بین دو ژن فراهم می‌کند. با استفاده از مقادیر کمتر یا بیشتر پرتوهای ایکس جهت ایجاد فراوانیهای مختلف شکست و در نتیجه قطعات با اندازه‌های متغیر می‌توان قدرت تفکیک نقشه برداری هیبرید پرتویی را تنظیم کرد. 

تکنیک FISH

نقشه برداری ژنی با استفاده از هیبریدسازی فلورسانس درجا

با استفاده از شیوه هیبریدسازی درجا که شامل هیبرید کردن مستقیم کاوشگرهای DNA یا RNA نشاندار با کروموزومهای متافازی است، می‌توان محل ژن را مستقیما مشاهده کرد. دو رشته DNA کروموزوم متافازی را در روی لام از هم جدا می‌کنند تا هیبرید کردن با یک کاوشگر نشاندار مقدور شود. سپس محل علامت هیبرید سازی و در نتیجه جایگاه ژنی که کاوشگر با آن هیبرید می‌شود، در زیر میکروسکوپ تعیین می‌گردد. شیوه‌هایی برای نقشه برداری توالیهای ژنی تک نسخه‌ای به روش هیبریدسازی درجا ایجاد شده‌اند که شناسایی سریع کاوشگرهای هیبرید شده نشاندار غیر رادیواکتیو با ترکیبات قابل مشاهده در زیر میکروسکوپ فلوروسانس را امکان پذیر می‌سازند. حتی در یک گسترش متافازی منفرد می‌توان محل ژن مورد نقشه برداری را به راحتی دید.

هیبریدسازی فلوروسانس درجا (FISH) ، همراه با شیوه‌های نوار بندی برای شناسایی کروموزومها ، برای تعیین محل ژنها در ناحیه‌ای به اندازه 2 - 1 میلیون جفت باز در طول کروماتین بسیار متراکم شده یک کروموزوم متافازی یا پرومتافازی ، بکار می‌رود.نقشه برداری با قدرت تفکیک تا حدی بیشتر ، از طریق نقشه برداری FISH ، قطعات DNA با استفاده از رشته‌های کروماتینی اینترفازی (FISH رشته‌ای) که تراکم به مراتب کمتری نسبت به کروموزومهای متافازی دارند، قابل انجام است. از طریق نشاندار کردن با رنگهای مختلف ، نشانگرهایی به نزدیکی چند صد کیلو باز از هم ، جداسازی شده‌اند و ترتیب آنها در رابطه با یکدیگر تعیین شده است. FISH رشته‌ای در تحقیقات پیرامون شناسایی ژنهای بیماریهای انسانی بسیار کمک کننده بوده است. زیرا این روش اطلاعات جزء به جزء در مورد ترتیب و فاصله بین هر یک از ژنها در مجاورت یک ژن بیماری فراهم می‌سازد